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              致電我們

              400 118 0390

              MALDI 質譜成像技術因其獨特的技術優勢,包括實現多樣的分子 類型,復雜樣本上的分子空間分布等,已被多領域的研究引用

              MALDI 質譜成像技術因其獨特的技術優勢,包括實現多樣的分子 類型,復雜樣本上的分子空間分布等,已被多領域的研究引用

              近年來,在檢測樣本表面目標分子的空間分布上擁有強大能力的 MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization) 質譜成像技術 (Imaging Mass Spectrometry, IMS) 越來越受關注。MALDI-IMS 已 被多種科研領域應用,并在多樣性分子的可視化檢測上不斷突破,其中檢測的分子種類已涵蓋各種有機 小分子,化學藥物,脂類,多肽及蛋白等 1,2。無需標記,在某些分子檢測上甚至無需任何復雜的前處理, 就可以同步得到多個或多種類分子在復雜樣本中,精確且高分辨率的空間表達,這些優勢毋庸置疑地成 為了 MALDI-IMS 的標志。MALDI 質譜成像技術不僅提供精確的分子質量分布譜圖信息,還能夠在復雜 組織的結構上呈現微米級空間分辨率的分子表達特異性,這些結果一方面為分析和觀察目標物的區域性 分布及組織在分子級別的結構性差異等方面帶來新的見解和發現;另一方面,作為創新的成像技術,可 在臨床領域輔助判斷受損或病變組織區域的分子構成和變化機制,并潛在輔助尋找腫瘤標記物等;同時, 基于特異性分子的 MALDI 質譜成像,還可以精準協助個體化疾病診斷及用藥和護理等方向的指導。 隨著逐漸對質譜成像技術需求的提高,標準化的檢測流程,包含樣本前處理與儀器采集性能在內 的方法學優化成為了首當其沖的攻克目標。本應用介紹了一種高空間分辨率脂質質譜成像采集的操作流 程,該操作流程使用基質升華法對組織進行前處理,在 MALDI-TOF MS (QuanTOF) 上采集質譜數據。 MALDI-TOF MS (QuanTOF) Imaging 的成像采集滿足 7S 指標 (Speed, Specificity, Spatial Resolution, Sensitivity, Stability, Simplicity & Size)3,4,為快速高效地達成高分辨、高靈敏的成像采集奠定了基礎。通 過我們的前處理及采集方法,可以快速且高效地得到靈敏度,重現性和分辨率均良好,可信度較高的脂 類成像數據。通過 QuanIMAGE 質譜成像系統對數據的進一步處理和分析,可以得到清晰的多樣性脂類 分子在組織內微米級別的結構分布成像,基于譜圖的疊加與對比,成像的同源性分析等多種功能的應用, 為進一步分析目標脂質的區別性表達帶來潛在的應用價值。

              實驗

              ?樣本前處理直接影響質譜成像數據的采集與分子成像的效果。本應用中,根據我們優化的組織前處理操作流程,經過多次實驗 驗證其穩定的高分辨譜圖及成像結果,確認了其在脂質分子范圍內成像應用的實用性

              A typical MSI workflow detailing steps from study design to reporting. (Figure modif ied from Swales etal., 20182 )

              【樣本制備】

              MALDI質譜脂類成像的前處理主要分為三步:樣本切片,基質升華和再水合。

              【樣本切片】

              質譜成像推薦使用新鮮組織樣本。新鮮解剖組織 (六周大鼠完整腦組織) 去除表面 明顯的殘余血跡后,立即放入液氮速凍 (或者異戊烷處理),5 min - 10 min 后將組織放 于-20℃ 恒定溫度環境中 (冰箱/冷凍切片機),繼續冷凍至少 1 小時。 準備就緒,使用OCT冷凍組織包埋劑 (Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 固定組織,使用冷凍切片機 (CM1900/3050: Leica Microsystems, Wentzler, Germany) 進行組織樣本切片,切片厚度控制在10 μm-12 μm。使用ITO導電玻璃 (Intelligene Biosystems, Qingdao, China) 貼附切好的樣本切片,在低溫的冷凍切片機內使用指腹 在切片背側加熱至完全融化貼合,以避免組織發生卷曲錯位。

              【基質升華】

              樣本切片在真空干燥器 (悅城) 中進行15分鐘干燥后,固定于升華裝置內 (ACE Glass) 進行升華處理: 基質:300 mg 1,5-DAN (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, U.S.A) 真空條件:4E-2 mbar 升華溫度:145℃ 2 mins + 150℃ 4 mins (6-min-process)

              【再水合】

              升華后樣本切片避光密封于切片盒/50 mL離心管內 (使用Parafilm進行密封),放 入-20℃冰箱2小時5 。再水合后樣本在切片盒內可使用鋁膜避光真空封裝,4℃環境內 保存,三天內完成樣本采集。

              【質量校準】

              Standard Kit:Bradykinin Fragment 1-7 & Angiotensin II, CHCA

              【樣本檢測】

              再水合后樣本/從真空密封狀態取出的樣本可進行短時間的常溫恢復及真空干燥, 樣本放置于MALDI-TOF MS (QuanTOF) 成像載靶器上,通過控制器軟件(QuanTOF Controller)操作載入儀器內。選擇采集區域,設置采集方法后,提交采集任務進行自 動數據采集。采集完成后數據通過成像系統軟件 (QuanTOF Viewer) 進行成像分析。

              【MALDI-TOF MS 條件】

              采集機型:QuanTOF

              采集模式:線性離子模式 (Linear Ion Mode)

              聚焦質量:950 m/z

              激光頻率:5,000 Hz

              質量范圍:100-1,500 m/z

              加速電壓:10 kV

              檢測電壓:-0.8 kV

              激光能量:8 μL

              激光直徑:10 μm

              空間分辨率:10 μm

              單譜圖激光轟擊次數:10 shots

              結果與討論

              高空間分辨率的質譜成像結果普遍需要超長的采集時間,甚至需要把組織分割為多個 區域,先后加載到質譜儀中采集,以降低基質在真空下揮發/升華的影響(較大面積的組 織受到基質不均勻影響的主要表現包括陰陽面,成像不均勻等)。因此以成像采集的速 度與效率兼得為主的目標被視為主要的攻克難點之一6。升華法沉積基質后的效果請參考 圖片1(Figure 1),基質附著均勻,組織輪廓清晰。使用QuanTOF MS進行成像采集,空 間分辨率為10 μm的完整大鼠鼠腦成像數據 (質量校準點數據除外) 共計120 GB,采集總時 長約4小時20分鐘??傮w質量出峰分辨率 (Resolution) 可達到同位素峰間分離 (Figure 2) ,低質量區域可達到基線分離。單譜圖平均分辨率可達1.5K+,最高可達2K+。譜圖上組 織內區別性表達的分子出峰信息豐富,質量精度可達到0.25 Da (250 ppm) 以內。從成像 結果上可見單分子在組織結構的區別性分布,成像完整,區域細節化清晰且空間分辨率 良好 (Figure 3 & 4)?;谫|譜成像的7s指標,2020年質譜成像專家Dr. Marvin Vestal 提 出的全新概念4,以標準化質譜成像的采集儀器的性能及特點。通過此次實驗的驗證,質 譜成像結果達到7s標準

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              Figure 2: The spectrum with high resolution performed in IMS (Negative Ion Mode).

              A. Single spectra with 10 laser shots. B. The accumulated spectrum selected from the region of cerebellum.

              C. the cerebellum region selected for generation spectrum B.

              7s 指標

              Speed 速度

              速度指標由多個采集參數共同決定,主要包含高激光頻 率(High Laser Rate = 5 kHz),激光掃描速度 (Motion of Sample Relative to Laser Beam = 5 mm/s),高離子化效率 (High Ionization Eff iciency ~ 50%),高速采集,處理&質譜數 據保存速率 (High Rate ~ 500 spectra/s)。速度的局限性也與 樣本采集的質量范圍,組織樣本處理后的分子濃度與空間分 辨率直接相關。我們此次結果的采集基于QuanTOF MALDITOF MS Imaging 可達到的最高成像采集速度500 pixel/s (with 10 laser shots/pixel),平均采集速度 300 pixel/s。

              Specificity 質量精確度

              質量精確度與質量分辨率有關,受到儀器本身的功能性 與樣本中分子的元素組成 (Elemental Formula) 局限。通過 校準品的外標法校準,我們可以得到同位素峰的質量偏差在 ±0.25 Da (250 ppm) 區間內的準確度。

              Figure 3: The single ion chromatogram of the mass of 888.6 Da.

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              Sensitivity 靈敏度

              質譜成像的分子采集靈敏度由離子化效率決定。離子化 效率與樣本本身和基質的性質直接相關,即會受到樣本處理 和實驗前處理的影響。由微米級的激光光束直徑通過少次激 光轟擊 (laser shots = 10) 樣本表面使樣本可離子化的分子氣 化,信號強度同樣受到樣本表面的分子濃度影響。

              Stability 穩定性

              在該次采集的大鼠鼠腦樣本,連續采集空間分辨率10μm 的完整成像共計激光轟擊次數~3千萬次 (Total Laser Shots = 33,613,500) 。采集過程中真空值穩定在8E-7 Torr,離子源 未清洗狀態下完成采集任務,激光聚焦保持穩定的10 μm, 采集能量輸出穩定 8 μJ。 在我們的采集中未觀察到采集過 程出現明顯波動,結果上成像細節呈現均勻。

              Spatial Resolution 空間分辨率

              空間分辨率直接受到儀器硬件的激光光斑直徑影響。 QuanTOF MALDI-TOF MS Imaging的激光光束聚焦直徑可 以達到10 μm。定制化的儀器的激光光斑小于5 μm。

              Simplicity 簡化性

              除去前處理需要手動實驗外,成像采集過程全部由儀器 自動完成。成像采集的方法設置也無需專業指引,可自主根 據實驗所需條件自由且快捷地完成調整。

              Size (million pixels) 數據量

              除去校準品采集的數據量,該次大鼠鼠腦成像數據量為 ~120GB大小,涵蓋~3百萬譜圖 (3,361,350 spectrum),約3.4 百萬像素 (10 μm ×10 μm)。